Рекомендации по стандартизации лабораторной диагностики лекарственно-индуцированной тромбоцитопении
Рекомендации по стандартизации лабораторной диагностики лекарственно-индуцированной тромбоцитопении (Общество специалистов по тромбозу и гемостазу).
Лекарственно - индуцированная тромбоцитопения (МИТ) – угрожающее жизни состояние, которое часто бывает не распознано. Клинические критерии позволяют заподозрить наличие этого состояния, однако требуется подтверждение диагноза с выявлением антител к тромбоцитам. Методика должна быть в состоянии подтвердить следующую информацию 1) связь с медикаментом; 2) способность антител связываться с тромбоцитами; 3) в идеале должна воспроизводиться во всех лабораториях.
Данный документ создан для улучшения стандартизации лабораторной диагностики иммунной тромбоцитопении, развивающейся в ответ на прием наиболее распространенных лекарственных препаратов: хинин, ванкомицин, сульфаметоксазол/триметаприм, а также пиперициллин/тазобактам. Рекомендации основаны на опыте работы референсных лабораторий в США, Канаде и Германии.
Рекомендации
1. Забор образцов крови.
Время забора крови: забор образца крови должен осуществляться в остром периоде тромбоцитопении как только возникло подозрение на наличие МИТ. Если к моменту исследования тромбоцитопения разрешилась, рекомендуется использование образцов крови, взятых у пациента ранее во время острой фазы заболевания (если это возможно). Анализ может проводиться в течение 3 недель после острой фазы тромбоцитопении, в дальнейшем чувствительность теста снижается.
Антикоагулянт в образце: для проведения исследования подходит сыворотка после свертывания крови или образцы крови с цитратом. Добавление ЭДТА следует избегать, поскольку это вещество может вызывать формирование гликопроетиновых комплексов (включая гликопротеин IIb/IIIa), связывая антитела против GP IIb/IIIa. Если пробы с ЭДТА хранятся, они могут быть использованы для анализа после проведения рекальцификации.
2. Подготовка тромбоцитов к исследованию.
Для проведения теста требуется наличие тромбоцитов (как субстрат для связывания антител). Очищенные гликопроетины тромбоцитов не могут быть использованы с этой целью, поскольку они меняют свою третичную структуру, а , следовательно, и антигенные свойства.
Источник тромбоцитов: либо свежевыделенные тромбоциты из крови здоровых доноров, либо тромбциты, хранящиеся в 0,1% р-ре азида натрия. В случае использования «свежих» тромбоцитов, кровь должна быть взята у донора методом крайне аккуратной аспирации (не с помощью вакутейнера) через иглу диаметром 21G (Диаметр изделия 0,8 мм, а длина – 40 мм, прим. переводчика); донор должен быть в положении сидя. Наложения жгута следует избегать вовсе, либо накладывать его очень щадящее для избегания активации тромбоцитов in vivo.
У донора должны отсутствовать сопутствующие заболевания. В течение как минимум 7 дней доноры не должны принимать какие-либо исследуемые препараты, которые могут каким-либо образом влиять на функцию тромбоцитов (включая НПВС и иные противовоспалительные препараты). Доноры должны иметь первую (О) группу крови и экспрессировать антигены HPA-1a для того, чтобы в качестве позитивного контроля можно было использовать анти-HPA-1a антитела. Кровь для выделения тромбоцитов должна помещаться в цитрат, растворы CPD, ACD-A или ACD-B. Выделение тромбоцитов должно осуществляться путем осторожного центрифугирования (120хg, 20 мин, при комнатной температуре). Пеллеты для центрифугирования следует дважды промывать в фосфатном буферном растворе (PBS). Число тромбоцитов в конечном итоге должно быть доведено до 500х106/мл с использованием фосфатного буфера.
3. Методы определения
Для выявления антител может быть использованы как проточная цитометрия, так и иммуно-ферментный анализ.
Проточная цитометрия: тромбоциты здорового донора выделяются и инкубируются с исследуемой плазмой в присутствии и в отсутствии лекарственного препарата. Затем тромбоциты отмываются буферным раствором, содержащим лекарственный препарат в той же концентрации. После отмывания тромбоцитов лекарственно-зависимые тромбоцит-ассоциированные иммуноглобулины определяются с помощью проточной цитометрии (используя антитела IgG и IgM к человеческим антигенам с флюоресцентными метками). Аналогично проводится тест для среды без лекарственного препарата (тромбоциты отмываются буфером без лекарства) для подтверждения специфичности реакции.
Иммуноферментный анализ: тромбоциты изолируются из крови здоровых доноров и помещаются в лунки микроплашек. Исследуемая сыворотка инкубируется с тромбоцитами в присутствии лекарственного препарата и буфера. После отмывания тромбоцитов антитромбоцитарные антитела определяются с использованием связанных с ферментами молекул антител IgG и IgM к человеческим антигенам.
4. Образцы от пациента и контрольные образцы
Изучаемые образцы (а также позитивный и негативный контроль) должны быть исследованы с/без лекарственного препарата в одинаковой концентрации.
Концентрация препарата и его растворимость. Лекарственные препараты должны быть использованы как минимум в терапевтической концентрации, хорошая стартовая концентрация 1 мг/мл (таблица 1).
Таблица 1. Терапевтические концентрации основных препаратов, тестируемых на МИТ.
*-концентрация зависит от времени, дозы и способа введения
Несмотря на то, что супратерапевтическая концентрация ванкомицина 1 мг/мл может давать ложно-положительную реакцию с нормальной контрольной сывороткой, использование такой концентрации позволяет получить водный раствор плохо растворимых препаратов (Сульфа).
Тестируемый лекарственный препарат должен также обязательно присутствовать в растворах, которыми отмывают тромбоциты, чтобы избежать диссоциации лекарственно-зависимых антител на этапе отмывки.
Растворимость ряда лекарственных препаратов может затруднять проведение исследования. Например, сульфаметаксазол и триметоприм слабо растворимы в водных растворах с нейтральной рН. Для получения растворов лекарственных веществ большей концентрации могут быть использованы спиртовые растворы лекарствееных препаратов (разведенные затем буфером), либо лекарственные вещества, растворенные в буфере с использованием перемешивания и добавлением р-ра 0,1 ммоль/л NaOH или HCl для поддержания pH. Эффективным способом повышения растворимости сульфаметаксазола (и повышения концентрации раствора до 1-2 мг/мл) является растворение препарата в буфере, содержащем 5% бычьего альбумина.
Сыворотки для положительного контроля: идеальной сывороткой для положительного контроля является сыворотка пациента с доказанной медикаментозно-индуцированной тромбоцитопенией с наличием антител, специфичных для исследуемого лекарства. Обычно такие сыворотки редко бывают доступны. Приемлемая альтернатива – сыворотка от пациента с МИТ, специфичная по отношению к другому лекарственному препарату, либо сыворотка, содержащая анти-НРА-1а антитела (стандарт ВОЗ 106/05, либо местно подтвержденный положительный контроль на антитела к тромбоцитам), чтобы, как минимум, обеспечить, чтобы регистрировался положительный ответ на связывание антител. Если используется анти-НРА сыворотка, следует использовать тромбоциты от НРА-1а позитивных доноров для того, чтобы избежать ложноотрицательных результатов.
Сыворотки для отрицательного контроля: идеальная контрольная сыворотка – это сыворотка пациента, который получает тот же лекарственный препарат, что и исследуемый пациент, но у него нет тромбоцитопении. Учитывая, что такая сыворотка не всегда доступна, может быть использована сыворотка здорового донора. Кроме того, исследование сыворотки пациента без добавления лекарственного препарата является важным шагом для подтверждения зависимости иммунной реакции от данного лекарства.
5. Интерпретация результатов.
Тест на наличие лекарственно-зависимых антитромбоцитарных антител расценивается как положительный, если в образцах сыворотки пациента выявляется связывание антител с тромбоцитами в присутствии лекарственного препарата, и не выявляется в отсутствие препарата. Различие в значениях интенсивности флуоресценции (при проведении цитометрии) или оптической плотности (иммуноферментный анализ) должно быть как минимум в 2 стандартных отклонения от значений, полученных в образцах без добавления лекарственного препарата. Другим подходом является расчет частного от деления значений интенсивности флуоресценции или оптической плотности, полученных с лекарством, на значения в пробах без лекарства. Значения частного более 1,5 являются отрезной точкой для положительного результата. Тем не менее, каждая лаборатория должна установить собственные отрезные точки путем тестирования 10-20 образцов сыворотки здоровых доноров и проведения статистического анализа полученных данных.
Положительный результат теста на выявление лекарственно-зависимых антитромбоцитарных антител характеризуется высокой специфичностью. Т.о., пациенты с положительным результатом исследования в будущем должны избегать приема соответствующего препарата. Отрицательный результат не исключает наличия синдрома, что приводит к низкой чувствительности теста со специфическим лекарственным препаратом. Возможные причины ложноотрицательных результатов: 1) причиной МИТ является не само лекарство, а его метаболит; 2) плохая растворимость лекарства и невозможность приготовить его раствор для исследования; 3) отсроченный анализ (после разрешения тромбоцитопении), когда уровень антител снизился или они исчезли вовсе; 4) иная причина тромбоцитопении (в том числе, индуцирование другим лекарством). У пациентов, у которых МИТ подозревается с высокой вероятностью, но результат теста отрицательный, необходимо аккуратно попробовать повторный прием лекарства. Это может быть полезно в том случае, если препарат используется часто (например, ацетаминофен).
По материалам:
Donald M. Arnold, Brian R. Curtis, Tamam Bakchoul; for the Subcommittee of Platelet
Immunology of the Scientific and Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis. Recommendations for standardization of laboratory testing for drug-induced immune thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH. 'Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2015. Accepted Article, doi: 10.1111/jth.12852.